目前基因工程制备蛋白最常用的方式仍是使用大肠杆菌为载体，进行培养发酵，完成蛋白质的大量制备。大肠杆菌由于其具有原核表达体系，所以作为工程菌有着巨大的优势，如操作简单、生长时间快、成本低、产量高等。但是，外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，通常会形成不溶的、无活性的包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
1、引言
目前基因工程制备蛋白最常用的方式仍是使用大肠杆菌为载体，进行培养发酵，完成蛋白质的大量制备。大肠杆菌由于其具有原核表达体系，所以作为工程菌有着巨大的优势，如操作简单、生长时间快、成本低、产量高等。但是，外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，通常会形成不溶的、无活性的包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
包涵体是细胞内聚集成的具有膜结构的非结晶性蛋白质固体颗粒聚集体，其中一般含有50%以上的重组蛋白，还含有一些内毒素、核糖体元件、外膜蛋白（ompC、ompF、ompA）、RNA聚合酶、环状或缺口的质粒DNA以及一些脂质和其他菌体蛋白，直径约0.1~3.0μm，具有很高的密度（约为1.3mg/ml），无定型，不溶于水，只溶于变性剂（变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽键的断裂），例如盐酸胍、尿素等。
在显微镜中可观察到，包涵体与胞质中其他成分有明显区别，在相差显微镜下呈黑色斑点状，所以也称为折射体（Refractile body）。包涵体需要经过溶解和一系列复杂的变性-复性及进一步的纯化才能获得高纯度的活性蛋白。
不过包涵体的形成也不全是坏处，其可避免细胞中蛋白酶对蛋白的降解，便于分离蛋白在一定程度上可以保护宿主细胞免受毒性蛋白的伤害。实际上，包涵体中蛋白的一级结构（即氨基酸序列）是正确的，只是其折叠聚集过程中出现问题，空间结构紊乱，导致其不具备生物活性。一般情况下，只需要对其进行分离提纯并恢复其原来的状态就可以得到我们生产所需的蛋白质。
2、形成机制
实际上，不管是大肠杆菌这类的原核细胞还是真核细胞在表达时都有可能会产生包涵体。包涵体蛋白质复性（renaturation，除去变性因素在适当条件下变性蛋白质恢复其天然构象和生物活性）与正确折叠过程和聚集过程的竞争有关。包涵体诱导产生的原因有很多，例如：
①蛋白表达量过高，使合成速度过快，以致于没有足够的时间进行折叠形成具有生物活性的正确结构。合成速度快会使浓度过高，聚集增加，则正确折叠减少。
②蛋白在折叠过程中疏水区暴露在溶液里，分子间的相互作用力导致了一些错误折叠的发生而凝聚。
③氧化-还原转换系统：表达环境的细胞内部还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，出现错配或多余的二硫键
④环境因素的影响：培养温度、pH值、某些金属离子等都会影响包涵体动力学的稳定
⑤原核系统缺乏真核系统对蛋白的加工修饰功能。
3、如何解决蛋白质生产效率过低的问题
从包涵体入手解决提高蛋白质生产效率的问题，是蛋白生产中十分可行的一个方案。一，我们可以直接减少包涵体的形成，二，引言中已说明包涵体实际上，有其存在的一定价值，包涵体中蛋白的一级结构（即氨基酸序列）是正确的，只是其折叠聚集过程中出现问题，对其进行分离提纯并复性仍可以得到我们生产所需的蛋白质。
3.1减少包涵体的形成
想要减少包涵体的形成，我们可以从其形成机制入手。
①培养环境的合理控制。良好的培养环境有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体。降低培养温度温度，控制在约20~25℃，可以减慢蛋白质合成速率，降低了无活性聚集形成的速率和疏水相互作用，可以减少包涵体的产生。pH值为碱性有利于二硫键交换，添加合理浓度的盐类与蛋白质稳定性和溶解性有关，离子对蛋白质稳定性和折叠复性的影响符合Hofmerister序列（霍夫梅斯特序列，SO42- > Cl- > NO3- > Br- > I- > ClO4- > SCN-，从左往右使蛋白质变性的能力逐渐增加，左边的硫酸根能够稳定蛋白质的天然结构）。
②添加促进重组蛋白可溶性表达的生长添加剂，例如高浓度的乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、多醇类、蔗糖或非代谢糖、低分子量的巯基或二硫化物（影响细胞周质还原态，而影响二硫键的形成）可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内，不会渗透进细胞，但其渗透压会导致对蛋白质具有稳定作用细胞内抗渗物（如甘氨酸甜菜碱）的累积。
③添加分子伴侣、折叠酶以及其他小分子添加剂，可以提高蛋白质折叠效率。
3.2包涵体蛋白复性
包涵体中蛋白的一级结构（即氨基酸序列）是正确的，只是其折叠聚集过程中出现问题，我们可以对其进行分离提纯并复性仍可以得到我们生产所需的蛋白质。主要步骤有：
3.2.1分离包涵体，工程菌发酵液浓缩经过裂解处理后，可进行过滤，分理出包涵体。
3.2.2洗涤，可除去包涵体表面附着的杂质，如膜蛋白、核酸等，通常用低浓度变性剂，也可以使用去垢剂TritonX-100洗涤去除细胞碎片和膜蛋白。
3.2.3溶解，高浓度变性剂（如6~8mol尿素，GdnHCl 6M盐酸胍）可通过强碱离子间作用力使包涵体的各种化学键断裂。还可以用去垢剂（SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等）破坏巯水键，TritonX-100溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。
3.2.4复性，恢复蛋白质的三维结构，使其恢复生物活性。可使用以下几种方法：①透析法，如果单用透析法，实际效果耗时长，易形成无活性蛋白聚集体，回收率不高。可以使稀释法透析法联合使用，已有实验证明该复性方法的正确折叠蛋白产率约可达95%。
②透滤复性法，速度快，但在超滤过程中易在膜上聚集变性，造成膜污染。
③稀释法，主要用分段稀释和连续稀释简单易实施，但不适用于工业放大，单独使用效果也不够理想。
④吸附复性法，肝素琼脂糖层析法、金属螯和层析法等可实现
⑤凝胶过滤层析柱复性法，既可以进行缓冲液交换式的蛋白复性，又可对蛋白质进行一定程度的纯化，虽然也可能造成蛋白聚集，但是可以与高蛋白质浓度复性法联合使用，是目前复性工艺的主要研究方向。
⑥反胶束复性法：用相转运技术将蛋白质分子包于反胶束中，使蛋白质分子相互分离。
⑦双水相法复性法：构成双水相系统。
3.2.5纯化：纯化时，需要使电导率、紫外吸收、盐浓度、pH 值均达到平衡，让条件温和稳定，可用膜过滤技术（超滤、纳滤）和多种层析方法完成纯化的工艺。例如，可以采用膜包10kd的超滤膜对45kd的蛋白进行浓缩，其超滤过程采用浓缩-稀释-浓缩的操作，即当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅拌均匀再重复浓缩，以尽可能过滤盐分和小分子杂质，以达到比较好的纯化效果。
纯化工艺确定后，还要对其进行验证。通过对各纯化步骤对细胞基质相关杂质、工艺相关杂质的去除效果以及对有效成分的分离纯化效果的验证，来评估纯化工艺的合理性。同时，还要关注纯化过程中污染的控制，进行中间产物（如超滤液、层析洗脱液等）及微生物限度的检测，并根据多批次的生产检定结果建立限度标准。
图1 包涵体蛋白复性工艺流程
4、总结
包涵体的形成的多数细胞培养生产蛋白的工艺中都会产生的问题，就目前来说，一般从两方面入手提高蛋白回收率，①减少包涵体的产生②将产生的包涵体进行二次加工，得到所需的活性蛋白，实现提高产率的目的。
从蛋白的复性工艺我们可以发现，现在用单一方式复性的效果并没有特别理想，越来越多的人朝着联合方式去提高产率，且已经得到了一些比较有价值的方式。相信在不久的将来，联合方式复性会成为主流方法，在市场中更具竞争力。过滤、层析与稀释法联合使用的蛋白复性方式十分具有市场前景。在杭州九龄科技有限公司生产的膜组件、层析组件可以基本满足生产的要求。
在未来，行业从业人员可以尝试开发将当前使用最广泛的复性方法——稀释复性、透析复性和柱复性等，集成在一台自动化的装置中。使该装置可以实现执行当前最广泛使用的复性方法或过程，使变性蛋白复性，并满足常规的蛋白质纯化操作。或许在不久的将来，可以快速满足市场的需求，实现行业的一大进步。