安全保证实践需要确保监管机构以及最终患者和公众最终的药品是安全的。20世纪90年代，国际协调会议(ICH 1998)颁布了“Q5A:人类或动物来源的细胞系生物技术产品的病毒安全性评估”(Q5A:病毒安全性评估)，为病毒安全性建立了一个世界性的标准。

ICH Q5A描述了一个用于测试和清除验证的多层方案，以实现这一目标。该测试项目的重点是细胞库、原材料和生物反应器收获，并辅以产品风险分析。除了测试之外，ICH Q5A还要求对下游的净化进行评估，作为在上游未检测到污染物时的故障保险措施。清除验证确保如果任何病毒逃避了测试制度，可以在最终药品中结束之前将其去除和/或灭活。

在现代生物技术制造(或生物加工)中，在整个纯化序列中通常有三到四个单元操作，能够去除或灭活病毒。这包括某些色谱步骤(如蛋白质A或阴离子交换)，低pH值或洗涤剂的培养，以及病毒保留过滤器。并不是所有这些步骤都能有效地清除或灭活所有病毒。

例如，低pH培养对非包膜病毒灭活通常无效，但对包膜病毒灭活效果很好。在某些操作条件下，阴离子交换柱可能无法结合和去除产物流中的中性等电点病毒，但对酸性病毒有效。

它是三到四个独立和正交的单元操作的组合，共同确保生物技术产品的病毒安全。

通常认为，一个健壮、有效和可靠的处理步骤将能够删除或灭活大量病毒(通常定义为4 log10或更大，其中日志减少值或LRV计算为输入总病毒数除以输出总病毒数的log10)。然而，LRV不能作为一个步骤有效性的单一绝对衡量标准。数据可能是初步的。容易建立模型，对工艺条件的变化相对不敏感，并且对一系列病毒有效(WHO 2004)。

病毒过滤被普遍认为是这样一个强有力和有效的工艺步骤，是在生物技术产品制造过程中最大限度减少外源性和内源性病毒颗粒风险的总体战略的一个关键组成部分。

病毒式过滤器通常通过强大的、基于大小的留存机制发挥作用。基于这种强大的作用机制，病毒过滤器比色谱步骤更有可能为一系列病毒提供可预测的病毒保留。这是因为过滤器不太可能受到不同病毒物理化学性质的差异以及操作条件调节的病毒-树脂相互作用的影响。因此，病毒过滤步骤通常被用于设计良好的重组治疗性蛋白纯化工艺(EMEA 1996)，也已被证明在血浆加工行业具有稳健的性能。

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但是血液制品就象一把双刃剑,既抢救了成千上万人的性命,同时也存在传播疾病的可能,给人类健康带来威胁。据统计,1977 ~1984年美国至少有3万受血者接受的是感染艾滋病(AIDS)病毒的血液。1985年法国3000名血友病病人中有1200名因输血或血液制品感染了AIDS病毒。

世界卫生组织提供的资料表明,全世界5% ~10%的 AIDS病毒感染是因为输注了染有AIDS病毒的血液或血液制品。我国第一例AIDS患者就是由于使用了染有AIDS病毒的进口血液制品而感染的。另外，由于输注血液及血液制品传播乙肝、丙肝疾病的事件也有报道。

通过血液和血液制品传播的病毒种类很多,见表1。其中HIV、HBV、HCV几种病毒由于感染率高、危害特别严重,已受到国内外医学界关注。

正由于血液及血液制品有传播病毒的可能性,所以严重影响了其在疾病的预防和治疗上的应用。因此,在血液制品的生产中,必须加入病毒灭活、去除工艺,以保证血液制品的安全性。

要保证血液制品的安全性,除了对献血者加以选择,在可能的情况下予以免疫接种,以及对已采集的血液进行严格的化验等措施外,对血液制品进行灭活和去除病毒处理,是保证输血安全的重要环节。下面将详细介绍几种灭活、去除病毒的常用有效方法。

此方法的理论依据是通过对温度及作用时间的选择,使病毒结构的破坏速率远大于蛋白质结构的破坏速率。近50年的临床使用结果及近来的动物实验均证实:白蛋白在溶液状态下经60℃、10 h加热处理,即巴斯德消毒后,不仅能灭活HBV,也能灭活HCV和 HIV,使白蛋白成为在病毒安全上最可靠的一种血液制品。

近来,巴斯德法被扩大应用于生产IVIG、FVI、FIX、纤维蛋白原等产品的处理。Bridonnccu等在低温乙醇法生产IVIG工艺中加入此病毒灭活工艺,即在无稳定剂、低盐﹑酸性条件下实施巴斯德法,病毒滴度下降5 Log。Simmonds等在对英国临床应用的FVⅢ、FIX浓缩制剂进行了输血传播病毒(TTV)的检测中发现,未经巴斯德病毒灭活的产品,其TTV检出率为50%~75%,经过巴斯德灭活后的产品阳性检出率为0。

通过对英国84例使用未经灭活工艺处理的凝血因子产品的血友病病人进行检测,TTV 阳性率为27% ,而另一组19例使用加入病毒灭活工艺的凝血因子产品的病人仅检出阳性1例,阳性检出率为5%。因此,病毒灭活工艺对提高血液制品的安全性是非常有效的。

该法是由美国纽约血液中心Horowitz等首先建立的,其原理是有机溶剂可使类脂从病毒表面脱落,使病毒结构被破坏从而失去感染活性。常用的S/D法是使用三磷酸正丁酯(TNBP)与不同表面活性剂,如吐温80、Triton X100和胆酸钠组合。S/D法灭活血液制品中脂包膜病毒的效果已得到肯定,如以0.3%TNBP和0.2%胆酸钠于24℃处理FI浓缩制剂6 h,灭活HBV、HCV均>4 Log,HIV >4.5 Log,灭活 VSV和Sindbis病毒均>4.5 Log,而FVIII促凝活性的回收率>90%。大量经S/D法灭活的血液制品通过长期临床应用,已证明其安全可靠,因此被广泛采用。但该方法对细小病毒B19、HEV及其它非脂包膜病毒无灭活能力。

干热灭活法即冻干后的制剂经加热处理、干热杀灭病毒的方法。常用的干热法有60℃ ~80℃、 10~72 h加热法及80℃、72 h处理法。早在20世纪80年代初期,就有用60℃ ~80℃进行10~72 h加热处理FVIII冻干浓制剂和凝血酶原复合物。但现已证明这种方法不能彻底灭活HBV、HCV、HIV。而80℃、72 h干热处理已被证明能有效灭活HBV、HCV、HIV。最近还有将凝血因子冻干制剂进行100℃处理的报告。许金波等用100℃处理IgG 30 min，可灭活水疱性口炎病毒8.2 Log。还有人将冻干FVIII在68℃下处理72h后,在干燥状态下再经100℃加热处理0.5~1 h 。该法相对来说较为经济。

该法由Matthews等首先提出,其原理是某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构有强烈的亲和性,在适当波长的光照下易激活,从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构。已使用的光敏剂包括:血吓琳衍生物、补骨脂内酯衍生物、吩噻嗪类化合物、酞菁化合物和部花菁540等。这类方法的主要特点是对脂包膜病毒有高效灭活作用,能用于全血浆的病毒灭活,对血小板制品的病毒灭活是当前的研究热点。美国加利福尼亚大学实验医学系的科学家在100多种补骨脂内酯的化学改性产物中,筛选出一种新的补骨脂内酯衍生物S-59。用150 um S-59结合3 J/cm2 UVA照射处理血小板制品,能灭活>6.7 Log 的游离HIV、>6.6 Log 的细胞结合HIV,而血小板体外功能保存7 d后仍保持良好,现已获FDA批准进行临床试验。

在这些方法中,巴斯德消毒法和S/D法是得到美国FDA批准并在世界范围内广泛应用的。干热灭活法主要适用于冻干制剂的病毒灭活。光化学法对脂包膜病毒有较强的灭活作用,在欧洲已被用于全血浆的病毒灭活,并有应用于血细胞成分病毒灭活的广阔前景。然而,所有这些方法都存在各自的缺陷,如巴斯德消毒法对一些耐热病毒灭活效果不理想; S/D法不能有效灭活非脂包膜病毒;光化学法对一些血浆蛋白活性损伤较大。目前临床使用的追踪调查表明,没有一种病毒灭活方法能保证血液制品绝对无传播病毒的危险。

在血液制品生产过程中,采用一种灭活工艺并不能使病毒全部失活;另外,病毒本身是一种异源蛋白,如与制品一起输入人体会产生不良反应;同时由于技术水平的限制,目前还存在着未能发现或了解其特性的病毒,所以现有的病毒灭活方法不能保证这些病毒的灭活效果。因此仅仅灭活是不能保证制品安全性的,必须将其从产品中去除。因此病毒去除技术正日益受到人们的重视。下面简要介绍两种常用、有效的病毒去除工艺。

色谱技术是指利用各种组分与固定相亲和力或相互作用方面的差别,实现各种组分的分离。色谱技术作为生产血液制品的先进工艺,其本身即具有去除病毒的作用,特别是亲和色谱和离子交换色谱。对于离子交换色谱来说,洗脱型在去除病毒方面比穿透型更具有优势。表2为澳大利亚CSL公司生产白蛋白的工艺过程中,色谱技术对HAV去除率的数据统计。从表2中可以看出,离子交换色谱和凝胶过滤对去除HAV较为有效,总去除率达10.9 Log。

美国Baxter Healtheare公司在FVIII的生产过程中,利用anti- FVIII抗体处理的凝胶进行免疫亲和色谱,其对非脂包膜病毒如PPV和HAV的去除率可分别达到(4.2±0.1)Log和(5.3±0.9)Log。

对于一些表面直径较小的病毒如HAV和细小病毒B19等,利用纳米膜过滤则是最有效的去除方法。它利用蛋白质和病毒的大小差异及滤膜对病毒的吸附来分离病毒。荷兰Sanquin血液供应基地对在凝血酶原复合物生产工艺中增加一步二级 Planova 15N纳米膜过滤的去除病毒效果进行了实验室研究。研究发现,经纳米膜过滤后，HIV、HAV等病毒的去除率均有不同程度的提高(见表3)。

但此法应用于工业生产时可能会出现如下问题:首先，由于制品的高黏度及较大直径蛋白质的存在,滤器所选用膜的孔径不宜过小,从而限制了较小直径病毒如HCV的去除;其次,滤器生产过程中膜孔径大小控制的稳定性程度会影响病毒的去除;第三,当小于病毒颗粒直径的膜孔径被堵塞时，将会降低产品流速,影响产量。因此,选择性质及孔径大小均适合所处理产品需要的膜,是能否发挥纳米膜过滤去除病毒作用的重要因素。

在保证血源质量的前提下,灭活、去除病毒工艺是保证血液制品安全性的重要、必要手段。仅采用一种灭活病毒工艺,不能绝对保证血液制品的安全。而在病毒灭活工艺的基础上,增加色谱、纳米膜过滤等去除病毒工艺,则病毒去除率大大提高,病毒灭活、去除效果得到明显改善。目前,欧洲己明确提出,在血液制品生产过程中,必须至少分别采用一种灭活和去除病毒技术,以保证血液制品的安全。

在我国,大多数血液制品生产厂家在生产工艺中只运用一种灭活病毒工艺,如巴斯德消毒法、S/D法等,而未采用去除病毒工艺,严重影响了血液制品的质量。随着我国加入WTO,国内血液制品的生产工艺及质量标准必将与世界接轨,否则,既不能保证现有的国内市场份额,更不能与其它国家的同类产品竞争国际市场。

所以,我国血液制品生产厂家必须改进生产工艺,加强对病毒的灭活、去除处理,从而充分保证产品的质量及安全性。因此,我国血液制品生产厂家采用色谱技术纯化血液制品、去除病毒以保证血液制品的安全性,将是大势所趋。

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