病毒样颗粒（VLP）疫苗是一种基于病毒结构但不含病毒遗传物质的疫苗技术。它们通过模拟天然病毒的形态和表面抗原，激发强烈的免疫反应，同时因无法复制而具有更高的安全性。VLP疫苗是传统疫苗（减毒活疫苗和灭活疫苗）的更好替代品。VLP疫苗无法在体内复制，因此适用于包括孕妇或免疫系统受损的所有人。此外，来自具有分段基因组的病毒（如流感病毒、非洲马瘟病毒和蓝舌病病毒）的衣壳蛋白（包括其他结构蛋白）也可用于开发VLP疫苗，而无需担心像减毒活疫苗一样的基因重组问题。其次，VLPs能够模拟真实病毒结构，而不像灭活疫苗，其结构蛋白可能在灭活过程中被修饰，从而导致免疫原性受损。
图1.VLPs和嵌合型VLPs的形成机制
VLP疫苗的特点
1.结构类似天然病毒：VLPs由病毒的一个或多个结构蛋白（如衣壳蛋白）自组装形成，大小和形态与真实病毒相似。
2.无感染性：不含病毒基因组，无法复制或致病。
3.高免疫原性：颗粒结构能被免疫系统高效识别，激活B细胞和T细胞反应。可诱导中和抗体和细胞免疫（如HIV、HPV疫苗）。
4.安全性高：适用于免疫功能低下人群（如乙肝VLP疫苗）。
图2.已上市的VLP疫苗
VLP疫苗的生产系统
1.昆虫细胞-杆状病毒系统：
优点：高产量、成本低、适合复杂蛋白组装。
应用：HPV疫苗、埃博拉疫苗。
2.哺乳动物细胞（如HEK293细胞）：
优点：翻译后修饰更接近人类，适合包膜VLPs（如流感疫苗）。
3.酵母系统（如毕赤酵母）：
优点：快速、低成本，已用于乙肝疫苗。
4.植物系统（如烟草叶绿体）：
环保且可扩展，正在研发中（如诺如病毒VLP疫苗）。
VLP疫苗下游纯化工艺
VLPs表达系统的多样性导致下游纯化工艺不具有普适性。图3为一般下游工艺流程图。
图3.VLP疫苗的下游工艺流程
收获与澄清：
在细胞培养生产出的各种培养液中，除了含有大量目标物质以外，还存在许多细胞组织碎片及代谢产物等杂质，使得培养液呈现混浊或半混浊状态，如果直接用这种培养液进行浓缩操作，将会很快使超滤膜阻塞，而无法完成培养液的浓缩，并致使超滤膜报废。因此，培养液在浓缩之前，首先必须进行澄清处理，去除培养液中的大颗粒杂质，使其成为半透明或透明溶液，用这样的培养液进行浓缩，才可能使浓缩过程正常进行，确保超滤膜的使用寿命。培养液浓缩前的澄清处理是浓缩过程中一个关键的技术环节。
高效的澄清步骤需要兼具较高的固体颗粒去除能力以及较高的产品收率、易于放大、并且能够保护后期下游操作装置。
方法：
离心：差速离心去除大颗粒。
深层过滤：使用多级滤器（如1.2μm→0.45μm）澄清上清。
切向流过滤（TFF）：适用于大规模生产，可浓缩样品并去除小颗粒杂质。
在培养规模过大时，离心耗时长，深层过滤需要大量的深层滤膜，导致耗材的成本大幅增加。同时，对于高密度的细胞培养会使深层滤膜的载量降低，从而导致成本增加以及产品过度稀释。
TFF膜组件有平板膜包及中空纤维两种。TFF是由跨膜压差驱动，小于膜孔径的物质和杂质透过膜，而颗粒较大的细胞等杂质被截留。一般用于微滤澄清的膜孔径为0.45/0.22μm。中空纤维切向流微滤澄清可以直接处理高固含量料液，如高密度细胞培养液，可以省去离心和预过滤等步骤，步骤少，操作简单，膜通过清洗可反复使用，降低了设备投资和操作成本，符合模化自动化生产的要求。
超滤浓缩（TFF)：
目的：减少层析处理量，提高层析效率，保护层析柱。
一般情况下，应用超滤法（TFF）可使VLP浓缩100倍以上，杂蛋白去除率达99%。其中，中空纤维膜过滤技术具有温和低剪切力、不易堵塞、操作灵活、寿命长成本低、易于放大等优点，因此浓缩纯化VLP建议选择中空纤维。
使用超滤法进行浓缩纯化，选择合适的膜孔径至关重要，膜孔径直接决定了浓缩的效率和产品质量。一方面需要选择膜孔径能够使目标分子有效截留以保证收率，另一方面要充分考虑杂蛋白的去除效果和处理速度。因此最佳的原则为：选择可以截留目标分子的孔径最大的膜，并且尽量选择孔径分布均一的滤膜。
初级纯化：
1.沉淀法
聚乙二醇（PEG）沉淀：选择性沉淀VLPs，需优化PEG浓度和盐浓度以平衡收率与纯度。
2.色谱层析
亲和层析：
肝素亲和：利用VLPs表面负电荷特性（如HPV VLP）。
抗体偶联层析：特异性高但成本昂贵。
离子交换层析（IEX）：依据VLP表面电荷特性选择阴离子交换（如Q柱）或阳离子交换（如SP柱），需优化pH和盐梯度以避免颗粒聚集。
疏水相互作用层析（HIC）：基于VLPs表面疏水性，适合某些非包膜VLPs。
精细纯化：
分子排阻色谱（SEC，凝胶过滤）：
去除残留宿主蛋白、核酸或聚集体，同时缓冲液置换。分辨率高但通量低，通常作为最终精纯步骤。
多模式层析：
如Capto Core系列树脂，结合离子交换与分子筛效应，可一步去除多种杂质。
病毒灭活/核酸去除（若需）：
核酸酶处理：如Benzonase降解宿主DNA/RNA。
UF/DF：配合TFF系统去除小片段核酸及酶。
浓缩与制剂：
切向流过滤（TFF）：
浓缩至目标滴度，同时置换缓冲液（如PBS或制剂缓冲液）。
无菌过滤：
0.22μm滤膜过滤确保无菌性。
典型案例
以下是典型VLP疫苗的下游纯化工艺。
关于九龄
九龄科技是一家专注于生物制药下游澄清、分离、纯化的生产型国家高新技术企业；产品广泛用于单抗、疫苗、诊断、血液制品、血清、内毒素等生物制品的过滤过程；九龄科技有“平板膜包与切向流过滤装置”、“中空纤维柱”、“除病毒过滤器”、“深层膜堆”、“除菌过滤器”、“超滤离心管”等产品，并拥有众多产品生产线，从小型一次性实验室过滤到生产型过滤系统，完全满足试验与生产的各项需求。九龄科技期待与您的合作！