综述：
本篇文章综述了蛋白质纯化策略中必须考虑的两个关键因素：下游应用需求和蛋白质自身的生物学特性。文章强调，高质量的蛋白质纯化是确保实验数据可靠性和可重复性的基础，尤其针对重组蛋白质的生产。不同应用场景对蛋白质的纯度、活性或内毒素含量等有特定要求，而蛋白质本身的特性也会显著影响纯化策略的设计。文章通过具体案例说明，针对不同蛋白质的独特性质需采用定制化纯化方案。最后，提出了一套系统化的蛋白质生产流程（图1），强调从表达系统选择、构建设计到纯化优化的全程质量控制，并推荐通过生物物理技术（如SEC-MALS、DSF等）评估蛋白质的均一性和功能性。本文旨在为研究人员提供实用指导，帮助其根据目标蛋白质的特性和应用需求，制定高效、可重复的纯化策略，从而提升科学研究的质量和效率。
图1.蛋白质生产流程示意图
高要求蛋白质生产——问题识别、缓解策略设计和相应输出的示例
1.核酸结合蛋白质：
在纯化核酸结合蛋白时，需多步骤去除核酸污染。裂解时需添加核酸酶（如Sm核酸酶（benzonase®）或DNase或RNase），但无法完全去除结合态核酸。替代核酸去除步骤，如PEI或链霉素硫酸盐沉淀、肝素纯化或离子交换色谱步骤。通过A260nm/A280nm比值监测整个纯化过程中核酸的存在，比值低于0.6，表明蛋白质纯度较高，核酸污染最小。对于强结合核酸的蛋白，可短暂变性（如尿素处理）后复性。关键点：使用高质量试剂、新鲜缓冲液和和干净的柱子（使用前用0.5M NaOH清洗）。
2.小鼠铁蛋白重链1：
生产纯化的小鼠铁蛋白重链1（mFth1）蛋白的目的是用于高分辨率单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）。大肠杆菌表达载体编码无标签的mFth1，在不添加任何核酸酶的情况下超声破碎细胞，70°C加热后，进行硫酸铵沉淀、透析和尺寸排阻色谱步骤，得到的样品在冷冻电镜图像中显示出大量污染物的存在（图2A），完全不适合其用途。优化步骤，在细胞裂解过程和硫酸铵沉淀后的透析过程中添加Sm核酸酶，随后添加阴离子交换色谱步骤，使A260nm/A280nm比值从1.4降至0.8。经尺寸排阻色谱后，最终mFth1样品的A260nm/A280nm比值为0.56，SDS-PAGE及冷冻电镜图像（图2B）显示蛋白质非常纯净，表明污染物已被有效去除。
图2.小鼠铁蛋白重链1
3.嵌合蛋白人dsRBEC（dsRBD-EGF-嵌合体）：
dsRBEC由人类蛋白激酶R的双链RNA结合域（dsRBD）和人类表皮生长因子（hEGF）融合而成。dsRBD在大肠杆菌中表达时显示出极高的dsRNA结合能力，细胞裂解后，污染物RNA会阻碍重组蛋白与固定金属离子亲和色谱（IMAC）柱的结合。PEI或链霉素硫酸盐沉淀、RNase处理或高盐缓冲液等常规方法无法去除RNA。使用含有4M尿素的缓冲液进行细胞裂解，上清液加载到IMAC柱上，4M到0M尿素缓慢过夜（柱上复性），用复性缓冲液加咪唑从IMAC柱上洗脱，Superdex 75凝胶过滤进行最终精制，获得具有功能活性的dsRBEC。
4.结合二价阳离子或其他辅因子的蛋白质：
对于与Zn2+、Fe2+、Cu2+等二价阳离子或其他辅因子相互作用的蛋白质，在表达过程中添加特定的二价阳离子（或其他辅因子）至关重要，在纯化过程中也需要少量相同的二价阳离子（或其他辅因子），但必须避免使用任何螯合剂（如EDTA、EGTA）和具有螯合特性的还原剂（如DTT或DTE）。在处理结合二价阳离子的蛋白质时，必须使用无螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物，通过光谱学方法（如原子吸收分光光度法）确认纯化蛋白质中二价阳离子（或其他辅因子）的实际存在。
5.来自嗜热蓝藻Mastigocladus laminosus含有单个[2Fe±2S]簇的重组铁氧还蛋白（rFd）
铁氧还蛋白是可溶性铁硫蛋白，参与电子转移反应。植物型铁氧还蛋白携带单个[2Fe±2S]簇，作为光系统I的电子受体。大肠杆菌BL21（DE3）菌株在含有10mM FeCl3和抗生素的TB培养基中表达重组rFd蛋白。使用含有10mM组氨酸的缓冲液进行IMAC捕获柱的洗脱，避免咪唑，防止破坏[2Fe±2S]簇。阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化，浓缩至12mg/mL用于结晶筛选。与重组生产的铁氧还蛋白相比，从蓝藻Mastigocladus laminosus纯化的天然铁氧还蛋白结晶时获得了更高的分辨率。
6.用作抗原的蛋白质
蛋白质常被用作抗原以回收靶标特异性配体。首先需要考虑的是蛋白质是用于体内免疫以获得常规单克隆或多克隆IgG，还是用于涉及骆驼IgG或体外选择过程的程序。
6.1用于常规抗体生产的抗原
当抗原用于生产单克隆IgG抗体时，抗原正确折叠通常非必需，因多数单抗识别线性表位，这些表位受抗原结构的影响不大，甚至变性抗原（如包涵体蛋白）仍有效。但需严格把控纯度，避免强免疫原性污染物干扰免疫应答，导致非目标抗体优势产生。
6.2结合物库的筛选
在骆驼免疫获得的纳米抗体库处理过程中需特别注意保持抗原的天然构象。与常规抗体不同，骆驼抗体（尤其是纳米抗体）倾向于识别结构表位，这与其独特的凸状互补位结构相关。类似地，在体外筛选大型合成或天然抗体库时，抗原必须保持与目标应用完全一致的结构。由于筛选过程本身无偏向性，若抗原存在错误折叠、聚集或构象异质性，可能大量筛选出针对非天然表位的结合物。
7、含有分子间或分子内二硫键或游离半胱氨酸的蛋白质
二硫键对于稳定蛋白质的天然结构至关重要。在纯化过程中，纯化含有分子间或分子内二硫键的蛋白质时必须避免添加还原剂，避免蛋白质构象变化，从而改变蛋白质的功能。对于含有游离半胱氨酸的蛋白质，在纯化过程的所有步骤中，尤其是在储存过程中，还原剂必不可少，以免形成人工二硫键。最常用的还原剂是二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇（β-ME）和三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）。对于与DTT或TCEP不兼容的IMAC树脂，建议使用β-ME，并在后续步骤中用其他还原剂替换。
8、重组抗体片段
重组抗体片段（如纳米抗体）虽然结构较IgG简化，但其功能依赖于二硫键的正确形成。在细菌表达系统中，即使采用优化策略，仍可能产生错误折叠或部分折叠的产物，这些产物既存在于可溶部分也存在于包涵体中。更隐蔽的是，即使正确折叠的抗体片段也可能通过表面疏水斑块形成可溶性聚集体（胶体聚集）。这类聚集体在常规功能检测（如ELISA）中难以识别，因为多价结合可能掩盖单体亲和力的下降，但其存在会严重影响依赖小分子尺寸的应用（如超分辨率显微镜）。因此，仅依靠SDS-PAGE不足以评估样品质量，必须采用凝胶过滤等生物物理方法（图3）来区分单体（主峰）与聚集体（排阻体积峰）。关键控制点包括：表达时优化氧化还原环境以促进二硫键形成，以及纯化后优化储存条件防止聚集。这些措施对确保抗体片段的单分散性和功能至关重要。
图3.纳米抗体可溶性聚集体的凝胶过滤分离
9、淋巴细胞受体LLT1的可溶性片段
重组表达依赖二硫键的蛋白质（如淋巴细胞受体LLT1）常面临折叠难题。野生型LLT1的凝胶过滤显示聚集峰和二聚体峰（图4A），但质谱揭示二聚体中仍存在未配对半胱氨酸导致的错误折叠（图4B）。为此设计两种突变体：一个去除问题半胱氨酸导致产量骤降（图4A）；而另一个引入新半胱氨酸重建保守二硫键后，突变体不仅产量高、稳定性好，还能结晶（图4C），且3D结构证实该突变体形成正确二硫键并保持天然折叠。这一案例表明，通过合理设计保守二硫键，结合凝胶过滤和质谱分析，可有效解决重组蛋白的折叠问题，获得结构稳定、高产的功能性蛋白。
图4.二硫键重构改善可溶性LLT1的折叠与得率
10、易聚集蛋白质
重组蛋白纯化常面临聚集问题，其形成遵循"成核-生长"机制——少量可溶性聚集体先形成，随后引发大规模不溶聚集。为应对这一挑战，需采取多层面策略：在表达阶段，可通过优化菌株、降低培养温度、使用改良的培养基或不同的增溶性融合蛋白、替代表达系统（昆虫/哺乳动物细胞）等；在纯化阶段，需快速操作（4℃环境）、避免蛋白过浓，并采用"快速纯化策略"（如IMAC直接衔接SEC）及时去除聚集体核。一般来说，缓冲液筛选应考虑组分组成、pH值、离液剂或促溶剂等因素（图5）。通过正交检测（SEC、CD、LS、DSF及基于荧热的温度位移等）精细优化，确定蛋白质质量和最合适的缓冲液。
图5.缓解蛋白质聚集的策略
11、人CLK1激酶的结晶（如何获得可重复批次）
为获得均质非磷酸化CLK1激酶用于结晶研究，采用多策略协同方案，首先在大肠杆菌中与λ-磷酸酶共表达以消除自磷酸化异质性，虽降低产量但确保去磷酸化完全。经IMAC捕获后，洗脱液补充稳定剂（50mM精氨酸、50mM谷氨酸和10mM DTT）防止聚集，浓缩，TEV酶切去除His标签，再通过SEC（含5%甘油和β-ME）分离正确寡聚体。最后的关键性阴离子交换步骤区分可结晶（非磷酸化）与不可结晶（部分磷酸化）CLK1群体。特别值得注意的是，细胞裂解方式显著影响蛋白稳定性——高压高温法导致CLK1不可逆聚集，凸显了温和处理对激酶制备的重要性。
12、生产稳定、配体结合能力的Galectin-1
为制备功能性Galectin-1用于配体结合研究，比较了四种构建体（无标签和His标记的野生型Galectin-1，无标签和His标记的无半胱氨酸突变体Galectin-1）的表达纯化策略。关键发现表明：基于乳糖亲和层析纯化能有效筛选正确折叠的蛋白，但需配合彻底透析（HEPES缓冲液）以完全去除结合位点中的乳糖，恢复CRD活性。野生型Galectin-1易氧化失活，即使在还原剂存在下稳定性仍有限（图6），而无半胱氨酸突变体通过消除二硫键依赖性，在保持与野生型相当的凝集活性和热稳定性（经nanoDSF、ITC等验证）的同时，显著提升长期稳定性。
图6.重组Galectin-1流体力学表征揭示其不稳定性
13、内毒素去除
内毒素去除方法基于包括带正电荷的层析（阴离子交换）、使用聚阳离子配体（如聚-L-赖氨酸（PLL）、固定化聚胺（多粘菌素B））的亲和层析、添加表面活性剂Triton X-114。纯化过程中注意使用LPS-free水制备缓冲液，使用新柱或仅在其他LPS-free纯化中使用过的柱子。对于内毒素污染，可在0.5M NaOH中孵育色谱泵/流体系统过夜或在1.0M NaOH中孵育4小时。使用鲎试剂（LAL）评估样品中LPS的最终量，并验证其是否低于特定应用所需的限制。
14、蛋白质复合物
蛋白质复合物的表达和纯化需根据具体条件优化，挑战包括亚基的不稳定性或错误折叠。可以单独表达各个亚基并在体外组装，或者共表达各个亚基以形成功能性蛋白质复合物。构建设计需谨慎引入纯化或检测标签，避免干扰组装，尤其在复合物信息有限时需多次优化。纯化过程中需评估复合物完整性和稳定性，方法包括SDS-PAGE（亚基检测）、SEC（均质性）、SEC-MALS（摩尔质量分析）、质量光度法或天然质谱（质量验证）。需注意低浓度下复合物可能解离，此时需优化层析方法或缓冲液（如通过热漂移或DSF筛选条件）。此外，减少纯化步骤可避免弱相互作用亚基丢失，平衡纯化效率与复合物完整性。
15、抗原-抗体复合物的纯化
抗体-抗原复合物是蛋白质复合物的典型范例，其共结晶可揭示结合模式，指导抗体工程化优化。传统方法需分别纯化抗原和抗体后混合，但近年研究表明共表达与共纯化策略更为高效，仅需单次纯化即可获得复合物，同时能通过抗体稳定不稳定抗原，甚至实现无标签表达。在这种特定情况下，SDS-PAGE和凝胶过滤（SEC）通常足以评估复合物纯度和质量。
总结
蛋白质纯化是科学研究的基础技术，学术规模的蛋白质生产通常遵循标准策略，可产出毫克级高纯度、可溶性蛋白，广泛应用于结构生物学、生物化学和功能研究。然而，下游应用的特殊需求（如动物实验要求无内毒素、核酸研究要求无核酸酶污染）或蛋白质本身的特性（如易聚集、含二硫键或高核酸亲和力）往往需要定制化方案。本篇综述针对这些特殊情况，提出从表达系统选择、构建体设计（优化标签和结构域边界）到纯化流程的精细化策略，并在关键步骤引入质量控制（如SEC、SDS-PAGE、活性检测等）。某些应用还需额外分析（如内毒素检测、核酸残留测定），类似生物制药行业的“质量保证”（QA）理念，即通过系统化流程预防缺陷。通过制定质量控制指南并明确科研用蛋白试剂的特定标准，旨在为学术实验室建立更严谨的蛋白质纯化规范，提升实验数据的可靠性和可重复性，弥合基础研究与工业标准之间的差距。
DOI: 10.1186/s12934-022-01778-5
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