基因治疗方兴未艾，但其高昂的成本仍是阻碍其惠及更多患者的壁垒之一，其中，腺相关病毒（AAV）载体的复杂生产工艺是推高成本的关键因素。一项发表于《Biotechnology and Bioengineering》的研究开发了一种基于切向流过滤（TFF）和表面活性剂的新型纯化方法，有望简化AAV纯化流程，降低成本。让我们一起解读这篇由东京大学团队带来的研究。
一、研究背景：AAV纯化的挑战与现状
AAV载体因其安全性高、免疫原性低、能感染分裂和非分裂细胞、实现长期基因表达等优点，成为基因治疗领域的“明星”递送工具。然而，AAV的生产制备过程复杂，特别是下游纯化步骤，通常涉及多次离心、层析等操作，不仅耗时费力，难以放大，而且成本高昂。
目前实验室规模的纯化多采用氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心法，但难以应用于工业生产。亲和层析法虽应用增多，但其所需的低pH洗脱条件可能会损害病毒感染性。因此，开发一种简单、高效、温和且易于放大的AAV纯化方法至关重要。
切向流过滤（TFF）是一种基于尺寸大小的分离技术，常用于生物制品的浓缩和换液。然而，传统的TFF在纯化AAV时，对宿主细胞蛋白（HCP）和DNA等杂质的去除能力有限，常常残留蛋白质聚集体。
二、创新方法：TFF联手表面活性剂，实现高效纯化
面对传统TFF的瓶颈，东京大学的Rimi Miyaoka和Yuji Tsunekawa等研究者想到了一个巧妙的策略：利用表面活性剂抑制杂质蛋白的聚集和相互作用，从而让它们能顺利通过TFF超滤膜（500kd截留分子量）被去除，而AAV病毒颗粒（尺寸约25nm）则被保留。
研究者测试了三种不同类型的表面活性剂：
●非离子型：辛基葡萄糖苷（Octyl glucoside）
●阴离子型：脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate）
●两性离子型：CHAPS
研究发现，单独使用非离子型表面活性剂效果不佳。而阴离子型的脱氧胆酸钠和两性离子型的CHAPS都能显著增强对残留蛋白的清除能力，且它们清除的蛋白群体有所不同。最终，将0.5%脱氧胆酸钠与1% CHAPS联合使用，效果惊人，几乎清除了所有的残留宿主蛋白，SDS-PAGE胶图上仅剩下AAV衣壳蛋白VP1/VP2/VP3三条清晰的条带。
图1 无表面活性剂的TFF纯化过程；（a）SDS-PAGE凝胶电泳；（b）透射电子显微镜（TEM）
图2 有表面活性剂的TFF纯化过程；（a）SDS-PAGE凝胶电泳；（b）透射电子显微镜（TEM）
三、研究成果：纯度、活性和安全性俱佳
1.高效清除杂质：这种新方法对宿主细胞蛋白（HCP）的清除率高达99.98%，对DNA的清除率达到95%，纯度可与亲和层析法相媲美甚至更优。
2.更好的感染活性：体外实验表明，用这种新方法纯化的AAV1载体，其感染HEK293细胞的效率显著高于通过亲和层析法纯化的载体（24.9% vs 20.8%），表明新方法更好地保留了病毒的生物活性。
3.良好的体内安全性：将纯化后的AAV1载体局部注射到小鼠骨骼肌后，两周后观察未发现明显的炎症反应或组织损伤，证明了其良好的体内安全性。
4.广泛的血清型适用性：该方法成功应用于从细胞培养上清液中纯化AAV1，AAV5，AAV8，AAV9等多种血清型。但对于主要存在于细胞裂解液中的AAV2，因杂质负荷过高，该方法仍需进一步优化。
四、总结与展望
本研究开发了一种简单、快速（仅需1.5小时）、高效且易于放大的AAV纯化新工艺。通过联合使用脱氧胆酸钠和CHAPS两种表面活性剂，成功解决了TFF纯化中杂质蛋白易聚集残留的难题。
该方法的优势在于：
●避免使用苛刻的低pH条件，更好保护病毒活性。
●减少层析步骤，简化了流程，降低了成本和时间。
●易于线性放大，非常适合工业化大规模生产。
●为其他生物大分子（如外泌体、其他病毒、重组抗体）的纯化提供了新思路。
当然，该方法目前也存在病毒回收率有待提高以及无法分离空壳和完整病毒颗粒的局限性，后者意味着它可能更适合作为纯化流程中的第一步捕获步骤。
总而言之，这项研究为AAV载体的下游生产工艺提供了极具吸引力的全新选择，有望为降低基因治疗药物的成本、推动其广泛应用做出重要贡献。
五、文献信息
Miyaoka R, Tsunekawa Y, Kurosawa Y, et al. Development of a novel purification method for AAV vectors using tangential flow filtration. Biotechnol Bioeng. 2023;120(11):3311-3321. doi:10.1002/bit.28524
六、关于九龄