摘要：慢病毒载体（LV）在基因治疗领域展现出巨大潜力，但其大规模生产，尤其是下游纯化环节，一直是走向临床和商业化的主要瓶颈。本期分享的这篇来自*Molecular Therapy Methods & Clinical Development*的研究，由芬兰库奥皮奥基因与细胞治疗中心的Anniina J. Valkama等人完成，系统性地开发并优化了一套可规模化的LV下游生产工艺，成功处理了180L的初始收获液，最终获得了高滴度、高纯度的临床级候选产品。本文将为您解读该研究的核心内容与重要发现。
一、研究背景：为什么下游工艺如此重要？
慢病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞，已成为基因治疗的热门工具，用于治疗癌症和血液疾病，更多疗法正处于临床试验阶段。
然而，将实验室规模的LV生产成功转化为满足临床需求的大规模生产充满挑战。LV颗粒脆弱，容易在处理过程中失去活性。上游生产（病毒培养）的规模扩大已取得进展，但下游处理（DSP：澄清、浓缩、纯化、制剂）则成为新的“卡脖子”环节。如何高效地从大量培养液中捕获、纯化并浓缩LV，同时保持其高感染活性并去除杂质（如宿主细胞DNA、蛋白质），是本研究致力解决的核心问题。
二、下游工艺全流程概览
1.澄清（Clarification）：去除细胞碎片和大颗粒杂质。
2.浓缩与缓冲液交换（TFF1）：使用切向流过滤（TFF）技术浓缩病毒液，并将其置换到适合层析纯化的缓冲液中。
3. 捕获纯化（Chromatography）：使用阴离子交换（AEX）层析作为核心纯化步骤，有效去除宿主DNA和蛋白质等杂质。
4. 最终制剂（TFF2）：再次使用TFF将纯化后的病毒置换到最终制剂缓冲液中，以确保长期储存的稳定性。
流程核心：尽可能减少步骤、缩短处理时间，以最大限度保持LV活性。
三、关键步骤的深度优化与发现
1.澄清：平衡杂质去除与病毒回收率
●挑战：需要高效去除杂质，同时避免病毒被吸附或机械损伤。
●发现：比较了不同孔径和材料的深度过滤器。较大孔径的过滤器虽然DNA清除率略低，但病毒功能活性回收率（75%-90%）显著更高，因此被选为最佳方案。
●重要技巧：过滤后使用缓冲液冲洗过滤器，可额外增加高达60%的病毒回收量，这一操作在放大生产中被证明至关重要。
2.切向流过滤（TFF1）：选择与优化
●挑战：浓缩过程会产生剪切力、压力变化和泡沫，可能导致病毒包膜破裂失活。
●膜材与截留分子量（MWCO）选择：
⑴材料：纤维素膜亲水性更好，跨膜压力（TMP）增长更慢，更不易堵塞，更适合大规模生产。
⑵MWCO：300kd膜DNA清除率更高，但100kd膜的功能病毒回收率更优。
⑶参数优化：本研究TMP控制在0.2-0.5bar，确定了关键操作参数（如通量、跨膜流速百分比），以确保高回收率（约75%）。研究还发现，在过程结束时关闭渗透流进行循环冲洗，可显著提高最终产物的回收量。
3.层析纯化：突破瓶颈的关键
层析步骤是下游工艺中回收率损失最大的环节，也是优化的重点。
●介质筛选：结果表明，Q膜析介质从浓缩液（TFF1产物）中回收功能性病毒的效果最好且最稳定。
●洗脱策略：线性梯度洗脱通常出现两个峰，第一个峰（在电导率开始上升时立即洗脱）含有最完整的病毒，杂质（DNA）较少；第二个峰含有大量DNA和少量病毒。优化后采用阶梯梯度洗脱（12%, 30%, 45%缓冲液B），成功将主要病毒产品富集在12%洗脱峰中，提高了目标产物的纯度。
●挑战与取舍：高盐浓度洗脱可以提高病毒回收率，但也会带入更多杂质。因此，必须在回收率和纯度之间找到平衡。该研究通过优化，实现了98%以上的宿主DNA清除率。
4.最终制剂：为病毒“保鲜”
LV的稳定性至关重要。研究团队筛选了多种最终制剂缓冲液（FFB），以评估它们在-80℃、4℃和室温下的保护效果。
核心发现：
●-80℃储存：含10%蔗糖的50mM HEPES缓冲液和含20mM MgCl₂的PBS缓冲液在保持病毒活性方面表现最佳，显著优于普通PBS。
●4℃和室温：所有缓冲液都无法完全阻止活性下降，但含5%蔗糖和20 mM MgCl₂的HEPES缓冲液相对最好。
●最终选择：结合上述发现，选择50mM HEPES + 20mM MgCl₂+ 10% sucrose （pH 7.5）作为最终制剂缓冲液，以兼顾长期冷冻储存和短期操作稳定性。
四、规模化生产成果
研究团队成功进行了两次大规模生产运行（一次使用LV-GFP，一次使用LV-TK），验证了工艺的可放大性。
第二次规模化运行（LV-TK）结果：
起始体积：178.4 kg（约180升）收获液。
最终产品：570 mL。
最终滴度：功能滴度高达1.97×109TU/mL。
总产量：1.12×1012个转导单位（TU）。
纯度：宿主DNA清除率达到99.8%。
产品质量：病毒颗粒与功能颗粒的比值（vp/TU）约为3.5×103，与同类大型生产报告的质量相当。
安全性：最终产品经检测，不含复制型慢病毒。
文献信息：Valkama, A. J., et al. (2020). Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 17, 717-730.DOI: 10.1016/j.omtm.2020.03.025