近年来，mRNA技术在生物医药领域取得了突破性进展，尤其是在疫苗和基因治疗方面展现出巨大的应用潜力。mRNA疫苗的成功研发不仅为传染病防控提供了新方案，也推动了肿瘤免疫治疗和个性化治疗的发展。作为一种新型治疗药物，mRNA的大规模生产具有挑战性，包括RNA的稳定性控制、去除残留酶类及反应副产物、缓冲液置换以及高纯度回收率的实现，需要具有监管机构批准方案的生产技术。
mRNA疫苗或药物的生产工艺，主要分为质粒DNA原液制备、mRNA原液制备、mRNA-LNP制剂制备三个阶段。
mRNA药物生产工艺流程图（图片源自网络）
切向流过滤（TFF）作为一种成熟的膜分离技术，以其高效的分子筛选能力、可控的缓冲液置换以及低剪切力特性，在mRNA生产中得到广泛应用。基于膜结构设计，常见的切向流过滤方式可分别平板膜包和中空纤维两种形式。此外，TFF的压力驱动膜分离可根据膜孔径大小分为微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）四类，选择性逐级增强。
TFF在mRNA药物的各个生产阶段发挥关键作用，包括质粒DNA原液的制备、mRNA原液的制备，以及最终的mRNA-LNP制剂的制备等环节。通过合理选择膜类型、膜截留分子量（MWCO）及膜材料，TFF不仅能够去除反应副产物和小分子杂质，还能在LNP包封前后实现缓冲液置换和浓缩处理，从而有效提升RNA的纯度、稳定性和最终产品的可放大性。此外，影响切向流过滤步骤性能的因素还包括泵驱动形式以及管路设计等配置以及诸如跨膜压（TMP）、剪切力以及过滤通量等过程参数，需根据目标产品的特性进行选择和优化，特别是对于mRNA-LNP这类对工艺过程中的外部应力条件较为敏感的产品。
质粒DNA的纯化
质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计，制备方法通常采用质粒DNA扩增，也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例，通常采用工程菌E.coli发酵来扩增，下游纯化工艺主要包括菌体收集、裂解澄清、浓缩换液、除菌过滤、线性化及层析纯化等步骤。工业上常采用连续流离心进行菌体收集，但剪切力较高。中空纤维因通道开放、剪切力低，更适合处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品（如质粒DNA）。收集后的菌体经高压均质、超声或碱裂解后，通过深层过滤初步澄清。
为便于后续层析，常先采用TFF（30kd/100kd/300kd的膜包和中空纤维柱）进行浓缩与换液，以减少样品体积，并同步去除部分RNA、宿主细胞蛋白（HCP）及DNA片段（HCD）等杂质。层析为核心精制步骤，一般阴离子交换层析（AEX）与疏水相互作用层析（HIC）联用，能高效地去除杂质并富集高生物活性的超螺旋质粒DNA，显著提高质粒纯度。纯化后的质粒需再次进行TFF，将质粒溶液浓缩至目标浓度（通常0.5-2mg/mL），同时，用最终储存缓冲液进行透析换液，去除工艺中的盐分和有机溶剂，确保缓冲体系符合下游IVT反应要求。
体外转录mRNA的纯化
体外转录（IVT）和修饰是mRNA原液制备的关键工艺。在IVT mRNA过程中，生产采用“切向流过滤（TFF1）—层析—切向流过滤（TFF2）”的组合方式，这种策略确保了mRNA的高效、高质量纯化，为疫苗的生产提供了关键支持。
在转录与修饰反应完成后，通常首先采用30kd/100kd/300kd的膜包或中空纤维柱进行超滤/洗滤处理。此步骤能有效去除反应体系中的多种工艺相关杂质，如RNA聚合酶、残留DNA片段、未反应的NTPs、加帽酶、双链RNA（dsRNA）以及小分子抑制剂等，同时实现缓冲液体系的置换。经过一步切向流过滤后，大多数杂质得到有效去除，可检测到的残留蛋白质杂质仅为RNA聚合酶。随后，采用多种层析技术进行精制纯化，常用方法包括亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析及离子交换层析等。经过上述超滤及层析步骤的串联纯化，mRNA的纯度已达到较高水平。为满足制剂或储存要求，需再次使用30kd/100kd/300kd的膜包或中空纤维柱，对mRNA原液进行浓缩或稀释，以精确调整目标浓度，并置换至最终配方缓冲液中。最后，通过除菌级过滤操作控制微生物负荷，完成物料的暂存与封装。
TFF相关工艺参数探索：相关研究发现膜截留分子量（MWCO）100kd纯化效率最佳；TMP不能超过5psi；1mg/mL的mRNA浓度可以保证较高的透过通量（>25LMH）。
mRNA-LNP制剂的纯化
脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA疗法研究最多的递送系统。目前，多种mRNA-LNP正处于临床前和临床开发的不同阶段。LNP对生产工艺相当敏感，在mRNA-LNP生产所需的单元操作中，通过TFF进行浓缩和缓冲液置换以及除菌过滤具有挑战性，必须进行优化以保证工艺的可放大性和产品质量，同时避免膜污染和过滤载量不正确等问题。
在对mRNA进行包封后，使用TFF进行纯化，其目的是去除未包封的mRNA、游离的聚合物或脂质材料，以及mRNA和脂质溶剂等。由于mRNA-LNP在室温下稳定性较差，因此优化包括TFF在内的下游工艺对于保持产品质量至关重要。
关键优化方向包括：根据mRNA-LNP的粒径和稳定性，合理设置TMP和切向流速，以平衡过滤效率与颗粒应力；筛选适宜截留分子量（MWCO）的膜包或中空纤维柱（100kd/300kd），在高效去除游离mRNA、杂质及置换缓冲液的同时，尽量减少颗粒吸附或损伤；优化浓缩与洗滤倍数，确保有效置换至目标制剂缓冲体系并控制最终粒子浓度与分散性。此外，工艺中需密切监测关键质量属性（如粒径、PDI、mRNA包封率），并根据实时数据动态调整参数，以实现稳定、可放大的高效纯化与制剂过程。
此外，由于mRNA-LNP及其成分在终端灭菌方法下的不稳定性，通常使用0.2µm除菌级过滤器截留细菌等微生物污染物。
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